固相多肽合成主要指的是將受保護的氨基酸衍生物連續添加到生長的肽鏈中，包括脫保護和洗滌步驟，以除去未反應的基團和副產物。如果每一步都是100%完成，那就會形成一個全長的肽，但是這種情況很難發生，因為無論合成方案如何優化，總是會存在副反應或者反應不完全的情況，從而影響肽的純度。因此，提高肽純度是固相多肽合成應用中的關鍵點。
01/
如何測定肽純度
肽純度的測量通常使用反向高效液相色譜法（RP-HPLC）和質譜法（MS），另外，氨基酸分析也可用于計算肽的產量或實際量。
02/
不同標準下肽純度的應用
固相多肽合成過程中最常見的雜質主要包括以下幾類：刪除序列、截斷序列、不完全脫保護序列、裂解過程中修飾的序列（肽上其他位置的保護基重新附著）、合成過程中形成的其他副反應產物（例如天冬氨酸亞胺形成、氧化產物等）、TFA（三氟乙酸）和乙酸等。
根據水平的不同，這些雜質中的一種或者多種會對您的應用產生直接影響。例如，特定的階段序列可以干擾研究中的靶向結合，或者TFA可以殺死生物測定中使用的細胞。那么，首先必須對合成本身進行優化，以確保正確的分子種類被合成達到足夠高的水平，使合成錯誤的、有問題的序列降低到非常低的水平。第二要優化下游的處理步驟，包括合成后鹽交換的步驟，通常需要對乙酸鹽進行藥物的物質和分析測試。第三還要檢查冷凍干燥的相對優勢以及與將肽保持在溶液中的穩定性測試等。
2.1
合成不同純度肽的應用指南
低純度（>50%）：該水平適用于先導化合物的高通量篩選。如果您正在研究免疫應答，除去特定的污染物，>70%可以用于抗原制備。
中等純度（>70%）：該水平足以生產、純化和測試免疫測定中使用的抗體、進行酶底物研究、表位作圖、親和純化、生物測定或其他免疫學應用以及肽篩選。生物化學和半定量應用可能需要達到>85%的純度。例如酶學、表位作圖或研究生物活性、酶-底物相互作用、磷酸化作用和蛋白質印記或細胞黏附中的肽封閉等。
高濃度（>90%）：該水平適用于定量生物測定、定量體外受體-配體相互作用研究、配體結合的生物活性研究、定量阻斷和競爭性抑制試驗、定量磷酸化和蛋白水解研究、電泳標記和色譜標準分析。
極高純度（>98%）：該純度適用于肽作為藥物進行體內研究、臨床試驗、藥物測試以及結構活性關系研究。
03/
優化合成以達到所需濃度
實現特定應用所需的純度意味著要最大限度地提高正確偶聯的效率，并最大限度地減少副反應、缺失、外消旋化等。難度可能因肽序列不同而異。長肽（>30個氨基酸）和復合肽在合成時本身就存在很大挑戰，一些特定區域（例如環狀或支鏈殘基）可能在合成過程中導致聚集，包括疏水性氨基酸或修飾。
3.1
合成前的關鍵優化步驟
序列分析：例如使用軟件在合成之前進行合成預測，以確定在整個合成過程中是否存在合成難度很大的區域。
副反應風險評估：例如外消旋化。有許多策略可以降低副反應的風險或有助于提高單個偶聯反應的效率，包括偽脯氨酸、二肽構建塊、添加劑以及替代側鏈保護。
3.2
固相多肽合成（SPPS）過程中關鍵步驟
樹脂選擇：SPPS通常在與1%二乙烯基苯（DVB）交聯的聚苯乙烯上進行。替代品包括聚乙二醇（PEG）衍生物，樹脂的選擇會影響合成成功率和粗品的純度。連接到柱上的連接物提供生長肽和固相載體之間的可逆連接，并確定最終產物的性質和可使用的化學性質。接頭的選擇決定了最終產物中的C端官能團。
偶聯化學：選擇通常取決于合成速度，較快的合成需要比較慢的合成（DIC、HBTU）更高反應性（=不穩定）的偶聯試劑（HCTU、HATU和COMU）。反應溫度會影響偶聯化學的選擇。
反應溫度：提高溫度可能會加快合成并提高純度，但并不總是如此。需要注意的是，基于微波的加熱只是加熱，微波本身對合成沒有特殊影響。
監控脫保護：能夠通過實時紫外監測來監控，例如脫保護步驟的效率對于優化是非常重要的。
雙重耦合：預測軟件確定的困難耦合可以通過雙重耦合、延長耦合時間或添加更多等效物來處理。
空間位阻：偶聯試劑必須足夠快速，以便可以引入空間位阻氨基酸。
封端：這樣做是為了在偶聯反應后永久阻斷任何未反應的氨基，或使完整肽的N-末端乙酰化。它對于在合成困難或長肽期間最小化缺失產物和輔助純化過程是有很用的。
溶劑使用：始終使用新鮮溶劑。重復使用溶劑會降低純度。
04/
選擇一種能夠快速合成高純度肽的多肽合成儀
影響如何優化SPPS以獲得所需肽純度的一個主要因素是合成儀的選擇。以下是一些幫助您選擇的建議
4.1
用于篩選方法和試劑的平行反應容器
正如我們所看到的，優化可以涉及查看大量的變量，并行運行不同試劑組合的能力將大大加快優化過程。
4.2
脫保護監測
能夠在運行期間監測脫保護步驟的效率，避免了可能導致不完全脫保護、缺失和副反應的情況。
4.3
溫度控制
提高溫度可以提高某些序列的純度。能夠同時測試不同溫度對提高生產率能力的影響。
4.4
最小交叉污染
提供試劑或樹脂交叉污染的多通道合成將加快優化并將再合成的風險降至最低。
4.5
稀有單體無需單次注射
特殊化學中使用的許多單體和試劑可能昂貴或珍貴，因此一些合成劑可從任何氨基酸/單體瓶位置提供免“單次注射”添加，以確保不會浪費任何東西。
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